熒光定量PCR的檢測(cè)離不開熒光定量PCR試劑和
qPCR熒光定量PCR儀，儀器由熒光定量系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)組成，用來監(jiān)測(cè)循環(huán)過程的熒光。與實(shí)時(shí)設(shè)備相連的計(jì)算機(jī)收集熒光數(shù)據(jù)。
對(duì)于熒光定量PCR儀的評(píng)價(jià)，相信大家一定是不知道的。熒光定量PCR儀涉及很多溫度、光電信號(hào)等，專業(yè)性評(píng)估，還有就是不知道從哪里入手。今天我們梳理下在核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室中如何通過試驗(yàn)來評(píng)價(jià)熒光定量PCR儀。
qPCR熒光定量PCR儀的試驗(yàn)設(shè)計(jì)：
一、試驗(yàn)準(zhǔn)備
1、有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：國(guó)內(nèi)外有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)類型為質(zhì)粒DNA或RNA。不推薦使用自制沒有進(jìn)行定量的質(zhì)控品。
2、熒光染料：可以選用試劑盒自帶的ROX染料或購買標(biāo)準(zhǔn)熒光染料。
3、熒光定量PCR方法：需要使用經(jīng)過驗(yàn)證過的熒光定量方法，擴(kuò)增效率90%-110%（越接近100%越好）；R2大于0.99；檢測(cè)限應(yīng)低于10copies/反應(yīng)。
4、反應(yīng)體系：質(zhì)量高口碑好的反應(yīng)體系。
5、耗材：儀器推薦使用的專用于熒光定量PCR的耗材。
6、反應(yīng)條件：常規(guī)熒光定量PCR反應(yīng)條件，普通模式，40個(gè)循環(huán)。不建議使用快速模式和預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)條件。
二、重復(fù)性試驗(yàn)
選擇高中低濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)（推薦濃度為5000copies/反應(yīng)、500copies/反應(yīng)和50copies/反應(yīng)），每個(gè)濃度至少5次重復(fù)，樣品管隨機(jī)放置在反應(yīng)板中心和邊緣的不同位置。Ct值變異系數(shù)不大于3%。
如果qPCR熒光定量PCR儀檢測(cè)中使用雙重或多重?zé)晒鈾z測(cè)，可設(shè)計(jì)如用FAM探針擴(kuò)增用VIC通道檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果不應(yīng)該有高于閾值線的熒光信號(hào)。
